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        實驗中磷酸化蛋白有哪些經(jīng)驗之談，以下為小編總結(jié)

        1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑，還要加入一定量的磷酸酶抑制劑，否則即使band壓出來也會很淺，結(jié)果也不可信。

        2.加一抗后最好4℃過一夜，保證抗體有充分的結(jié)合時間。因為磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分。4℃也可使一抗重復使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時即可。

        3.磷酸化抗體的好壞是一個關(guān)鍵因素，所以要選擇好的廠商。

        4.最好根據(jù)廠商的protocol來操作實驗，這是實驗成功的保證。

        5.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當，不同廠商也會有不同要求。

        6.研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達量。如壓完phospho-p38抗體后，把相同的membrane做strip后再壓p38，然后再strip一次，再壓內(nèi)標actin。

        7.做磷酸化蛋白WB時，除了目標蛋白的band以外，往往會出現(xiàn)非特異性的band。磷酸化抗體不好的話，甚至會壓出非特異性的band，而沒有你想要的band，所以壓片以后，你一定要根據(jù)markers比對一下，你壓出的band分子量是否正確。

        8.磷酸化蛋白WB時backgroud也往往較深，所以壓片時間要適當，不能太長或過短，太長則backgroud太深蓋住想要的那條band，時間過短則可能沒有band或者band太淺。

        9.磷酸化蛋白WB時，用TBST洗時也要注意一下，搖床的轉(zhuǎn)速不要太快，洗的時間不要太長，孵育一抗和二抗之后分別洗5min3次即可，寧愿background深一些，總比做不出來強得多。另外，洗的時候，最好不要把幾張membrane疊在一起洗。

        10.研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達量。這有兩種方法，一是：相同的sample在不同的well中上樣兩次（可在相同的gel上，也可在不同的gel），其一壓磷酸化蛋白，另一壓該蛋白總的表達量（包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白），甚至還可跑另一個gel，壓內(nèi)標。但是不建議如此做，因為這樣比較時誤差還是較大的。

        11.Strip時一定要注意：membrane一定要完全泡在stripsolution中（可用較硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受熱均勻。這一點很重要，要不然，隨后壓出來的總蛋白也好，內(nèi)標也好就會不均一，無法進行比較。

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