西安鼎天化工有限公司

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        西安化工新材料為您介紹磷酸化蛋白11點經(jīng)驗之談
        作者:西安鼎天化工有限公司:2015/12/21 10:27:05

                實驗中磷酸化蛋白有哪些經(jīng)驗之談,以下為小編總結(jié)

                1.一定要在lysisbuffer中加入蛋白酶抑制劑,還要加入一定量的磷酸酶抑制劑,否則即使band壓出來也會很淺,結(jié)果也不可信。

                2.加一抗后最好4℃過一夜,保證抗體有充分的結(jié)合時間。因為磷酸化的蛋白只占總的蛋白量的極少部分。4℃也可使一抗重復(fù)使用多次。畢竟磷酸化的抗體都挺貴的。二抗則室溫1小時即可。

                3.磷酸化抗體的好壞是一個關(guān)鍵因素,所以要選擇好的廠商。

                4.最好根據(jù)廠商的protocol來操作實驗,這是實驗成功的保證。

                5.抗體的稀釋倍數(shù)也要適當(dāng),不同廠商也會有不同要求。

                6.研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。如壓完phospho-p38抗體后,把相同的membrane做strip后再壓p38,然后再strip一次,再壓內(nèi)標(biāo)actin。

                7.做磷酸化蛋白WB時,除了目標(biāo)蛋白的band以外,往往會出現(xiàn)非特異性的band。磷酸化抗體不好的話,甚至?xí)撼龇翘禺愋缘腷and,而沒有你想要的band,所以壓片以后,你一定要根據(jù)markers比對一下,你壓出的band分子量是否正確。

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                8.磷酸化蛋白WB時backgroud也往往較深,所以壓片時間要適當(dāng),不能太長或過短,太長則backgroud太深蓋住想要的那條band,時間過短則可能沒有band或者band太淺。

                9.磷酸化蛋白WB時,用TBST洗時也要注意一下,搖床的轉(zhuǎn)速不要太快,洗的時間不要太長,孵育一抗和二抗之后分別洗5min3次即可,寧愿background深一些,總比做不出來強得多。另外,洗的時候,最好不要把幾張membrane疊在一起洗。

                10.研究完某一蛋白的磷酸化情況后最好也要研究一下該蛋白總的表達(dá)量。這有兩種方法,一是:相同的sample在不同的well中上樣兩次(可在相同的gel上,也可在不同的gel),其一壓磷酸化蛋白,另一壓該蛋白總的表達(dá)量(包括磷酸化和未磷酸化的該蛋白),甚至還可跑另一個gel,壓內(nèi)標(biāo)。但是不建議如此做,因為這樣比較時誤差還是較大的。

                11.Strip時一定要注意:membrane一定要完全泡在stripsolution中(可用較硬的塑料膜封好),然后要完全浸入水中,使受熱均勻。這一點很重要,要不然,隨后壓出來的總蛋白也好,內(nèi)標(biāo)也好就會不均一,無法進(jìn)行比較。

                中國化工儀器網(wǎng)為您提供磷酸化蛋白檢測的詳細(xì)介紹和價格,如有意向請聯(lián)系上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。我司供應(yīng)相關(guān)產(chǎn)品“

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